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古朵技术:细胞冻存与复苏详细解答!

发布时间:2020-08-03浏览次数:2869返回列表

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于 - 196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。


一、原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无-毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。

二、细胞冻存与复苏操作步骤
(一)冻存
1、消化细胞(同实验二),将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm 离心 10 分钟,弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养,计数,调整至 5×106/ml 左右。
4、将悬液分至冻存管中,每管 1 ml。
5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温:室温→4℃(20 分钟)→冰箱冷冻室(30 分钟)→低温冰箱 (-30℃ 1 小时)→气态氮(30 分钟)→液氮。
注意:操作时应小心,以免液氮冻伤。液氮定期检查,随时补充,不能挥发干净,一般 30 立升的液氮能用 1~1.5 月。

(二)复苏
1.  细胞实验室进行常规消毒,紫外照射 40min 以上。
2.  培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱 37°C 预热 20min,备用。
3.  二甲基亚砜(DMSO) 在 40°C 冰箱中冷藏 30min,备用。
4.  从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入 400°C 水浴中,快速摇晃,直至冻存液完全融化。
5.  将细胞悬液移入 15ml 离心管,缓慢加入 4ml 培养液,离心(1000r/min,5min)。
6.  用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,方培养箱中培养。

7.  记录复苏日期。
三、注意事项
1.  取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。
2.  冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是完全无-毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大,因此,必须在 1-2min 内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜(DMSO)选择进口产品。
3.  离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。
4.  离心问题:目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液。因为离心的目的是两个,去除 DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大, 死亡。此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO),DMSO 对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液 体前倒净,且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常。
5.  细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时 1ml 细胞液要加 10ml-15m 培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6.  复苏细胞分装的问题:试验中我的经验总结为复苏 1 管细胞一般可分装到 1-2 只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。
7.  加培养基的量放入问题:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是 DMSO 的浓度,从如果你加培养基的太少,那么 DMSO 的浓度就会比较大,就会影响 细胞生长,从以前的资料来看,DMSO 的浓度在小于 0.5% 的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是 1%。所以如果你的冻存液的浓度是 10%DMSO 的话那么加 10ml 以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度

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